Elisa

Konjugat ya alkalin fosfataz veya peroksidaz gibi ağır bir enzimle konjuge edilmiştir. İlave edilen konjugat,antijenle birleşmiş antikorla bağlanacaktır. Daha sonra enzime uygun substrat ilave edilir ve belli süre inkübe edilir. Reaksiyon NaOH vaya HCk ilavesi ile durdurulur. Ve sonuçlar spektrofotometre ile ve kullanılan konjugatın özelliğine göre,400-600 nm arasında okunur.(67,112)

Direkt ELISA testi,direkt floresan antikor testinin analoğudur ve antiviraı antikorla direkt olarak bağlanmış bir enzimden yararlanılarak uygulanır. Direkt yöntemin üstünlüğü inkübasyon basamağının az olması ve tek bie antiviral antikor ile gerçekleştirilmesinden kaynaklanmaktadır.Ancak her bir antiviral antikorun bir enzimle bağlanması gerekliliği,her antijen için işaretli bir antikor ihtiyacını ortaya çıkartmaktadır. Bu da çeşitli zorluklara neden olmaktadır( 112,114).

ELISA’nın muhtelif modifikasyonları kullanılmaktadır. Bunlardan biri de Double Antibody Sandwich metodudur. Bu metotda kullanılan 2. Antikor farklı bir türden elde edilmiştir. Bu antikorun antiimmunoglobulini enzimle işaretlenir ve raksiyona sokulur. Bunun avantajı spesifik antikorun işaretlenmesinden kaçınmaktır. Bu metot antikor aranmasında da geçerli bir metoddur (112)

Antijen aranmasında yararlanılan bir diğer yöntem ise, pleytler spesifik antijen ile kaplanır ve üzerine test numunesi ile referans antikor karışımı ilave edilerek inkübe edilir. Eğer numunede antijen yoksa referans antikor, sensitize yüzeydeki antijenle birleşir. Enzim işaretli antiglobulin ve substrat ilavesi yapılır ve substrat parçalanması gözlenir. Eğer numunede antijen varsa,referans antikorla birleşir. Yüzeydeki antijenle birleşme olmaz. Yıkama sırasında kompleks gider. Enzim işaretli antikor da bu nedenle komplekse bağlanamaz,yıkama ile bu da gider. Daha sonra substrat ilave edilir. Ancak reaksiyon gözlenmez. Yani substrat parçalanmasının inhibe edilmesi , numunede antijenin olduğunu gösterir. Substrat parçalanmasının inhibisyon miktarı, antijen miktarı ile orantılıdır (112).

Son yıllarda ELISA testleri, viral enfeksiyonun tanısında kullanılan klasik testlerden bir çoğunun yerini almaktadır. Klasik testlerde bir hastalığın serolojik tanısının konulabilmesi için akut ve konvelesan faz serumlarının birlikte incelenmesi ve ikisi arasında en az 4 titre artışının saptanması gerekmektedir. ELISA testi genellikle çift serum örneği ile çalışmaya gereksinim olmadığından daha pratiktir. Antijene spesifik IgG ve IgM antikorlarının belirlenebilmesi de bu testin diğerlerine üstünlüklerinden birini oluşturmaktadır.88,41,72,88)

İndirekt ELISA yöntemi,antikor miktar tayini için çok yaygın olarak kullanılan bir testtir. Ancak IgM gibi küçük miktarlardaki immunoglobulin seviyelerinin ölçümünde dikkatli olunması ve romatoid faktöre bağlı yalancı pozitiflik ile IgG antikorlarının çok yüksek olmasıhalinde yapışmaya bağlı olarak meydana gelen IgM yalancı negatiflik olgularının gözden uzak tutulmaması gerekir (6,22). Bu problemleri azaltmak için katı faz anti IgM ELISA yöntemi kullanılmaktadır.(27,38,41,73,89). Bu amaçla ilk adımda anti-IgM ile kaplı mikropleytler kullanılır. Serum numunesi üzerine işaretli antijen ve uygun substrat edilerek test değerlendirilir.

İndirekt ELISA’nını problemlerinden biri olan IgM yalancı pozitifliği, spesifik antijene bağlanan spesifik IgG antikorunun Fc parçasına, Igm romatoid faktörün (RF) bağlanmasından kaynaklanmaktadır.(6) RF ile ilgili nonspesifik pozitifliğin eliminasyonu için çeşitli teknikler geliştirilmiş ve bu amaçla agrege olmuş IgG, IgG ile kaplanmış lateks partiküller Stafilococcus aureus protein A ve sepharose kullanılmaktadır