Klonlama: Bir organizmanın herhangi bir DNA bölgesinin özgül olarak diğer bölgeler arasındanizole edilip başka bir yere ilave edilerek ifade olmasını sağlamaktır. Vektörler ise izole edilen DNA parçalarının yapıştırıldığı ve o parçaları taşıyan sistemlere denir.

Vektörün tanımını yapmamız gerekirse ; özel nükleotid dizlerinden restriksiyon endonükleazlarla kesilmiş DNA parçalarının alıcı hücreye aktarılmasını sağlayan yapılardır.



Bir vektörde bulunması gereken özellikler şunlardır:



1. Alıcı hücrenin kromozomundan bağımsız olarak kendini çoğaltabilmesi. Öyleyse bir replikasyon orijini olmalı.
2. Ona diğer hücreler arasından seçilebilmesini sağlayacak özelliği kazandıran bir gen taşımalı. Bunlar antibiyotiğe direnç veya metale direnç gibi genler olabilir.
3. Bulunduğu ortamdan ayrı bir molekül olarak izole edilebilmelidir. Bu bir virüs ise bakteri kromozomuna entegre olmamalıdır.
4. Tek ve özel bir restriksiyon endonükleaz kesim bölgesi bulundurmalıdır.

Bugün için kullanılan vektör sistemler şunlardır:

* Plazmid vektörler
* Viral vektörler
* Ekspirasyon ( shuttle ) vektörler
* Ti plazmidi
* Cosmid vektörler
* Yac Vector

PLAZMİD VEKTÖRLER

Plazmidler bakteri içinde ekstrakromozomal olarak bulunan , çift zincirli , çok kısa sürede ve otonom olarak replike olabilen yapılardır. Üzerlerinde antibiyotiğe direnç geni taşıyabilirler. Bir bakteriden diğerine aktarılabilirler. Büyüklükleri 7-9 kb olup türe özgüdürler. Bütün bu özelliklerinden dolayı vektör olarak kullanılmaktadırlar.

Bir marker taşıyan ( örn. Antibiyotiğe direnç ) plazmid ile klonlayacağımız DNA aynı restriksiyon endonükleazla kesilmelidir. Her iki yapıda da birbirinin komplementeri olan yapışkan uçlar meydana gelir. Iki yapı aynı ortama konup DNA ligaz ile muamele edilirlerse ortaya rekombinant bir DNA molekülü çıkar. Yanlış eşleşmelerde olabilir. Bu yanlış eşleşmeler ise vektörün içerdiği marker bölge ile ayırt edilir.

Genetik mühendisliğinde kullanılacak plazmidler belli sayıda kesim bölgeleri ve antibiyotiğe direnç genlerini içermesi için modifiye edilirler.

Bazen plazmid üzerinde bulunan kesim bölgeleri balli bir yerde toplanmıştır. Bunlara polilinker bölgeler denilmektedir. Örneğin pUC18 de bu polilinker bölge Lac Z geni üzerindedir.eğer klonlama başarılı olmuşsa normalde mavi koloni oluşturan E.coli hücreleri beyaz koloni oluşturmaya başlarlar. Çünkü LacZ geni iş göremez hale gelmiştir. Böylece rekombinant DNA dizilerini taşıyan hücreler diğerlerinden kolaylıkla ayıredilebilirler.

Plazmid vektörler , virüs vektörlerine göre , klonlanan DNA’nın daha kolay kullanılabilmesi olanağını sunar.

VİRAL VEKTÖRLER

Viral vektörlerin en büyük özelliği plazmidlere oranla – ki plazmidlerde en fazla 3500bp taşınabilir- daha büyük DNA parçalarının klonlanabilmesidir ( yaklaşık 15-35 kb ).

Viral vektörlerle çalışırken ilk yapılacak iş kullanılacak olan virusün gen haritasının çıkarılmasıdır. Böylece virusun hücre dışına çıkışını sağlayan kapsid ve assamble gibi gen bölgelerinin yerlerinin bulunup çıkarılması sağlanır.

Virusun sadece hücre dışına çıkışını engellemek yeterli değildir. Virusun bakteri içerisinde lizogenik faza geçmesine neden olan gen bölgesi de çıkarılmalıdır. Bütün bu işlemlerden sonra elimizde kalan yapıya bakacak olursak ; virus bol miktarda çoğalabileceği genlere sahip ama bu virus hücre dışına çıkamayacak halde. Virusun hücre içinde çoğalması için gerekli gen sayısı l bakteriyofajı için 35 kb dır. Yani bizim bu bakteriyofaj için kullanbiceğimiz kısım 15 kb’dır.

lvektöründe ik önemli bölge vardır. Bunlardan ilki klonlanmak istenen gen bölgesinin yerleştirileceği bölgede bulunan bir restriksiyon endonükleaz kesim bölgesi , ikincisi de vektörün her iki ucunda bulunan ve “ cos “denilen bölgelerdir. Bu uçlar DNA parçaısnın vektör kılıfına sokulması için gerekir. Klonlanacak DNA restriksiyon endonükleaz ile küçük parçalara ayrılır. Vektör de bu enzimle kesilerek insan DNA’sının herhangi bir parçasıyla birleşir ve virüs kılıfına sokulur. Daha sonra bu v.ruslar E.coli ‘yi enfekte etmek için kullanılır. Bakteri kültür ortamında oluşan her bir virus plağı DNA parçalarından sadece birini taşır. Insan DNA ‘sında çıkarılmak istenen özel DNA parçasının oluşturduğu plak özel teknikler kullanılarak diğer plaklar arasından kolayca seçilir. Daha sonra da ayrı olarak istendiği kadar çoğaltılabilir.

COSMİD VEKTÖRLER

Cosmid vektörler hem lvirus vektörü gibi cos bölgesi içeren , hem de plazmid vektörler gibi ori ve antibiyotiğe dirençlilik genlerini içeren DNA molekülleridir. Bu sayede, l vektöründe olduğu gibi rekombinant molekül virus parçalarına sokulabilir ve plazmid vektörde olduğu gibi bakteride çoğaltılıp seçilebilir. Cosmid vektörler , yaklaşık 45 kb büyüklüğünde DNA yı taşıyabilirler.

Cosmid Vektörlerinin Oluşum Aşamaları :

1. l
2. cos bölgesini içeren plazmid BamHI gibi bir restriksiyon endonükleaz la kesilir ve böylece linear hale getirilir. Linear yapı 5’ fosfatların uzaklaştırılması için alkali ile muamele edilir. Böylece yapının tekrar halkasal hale gelişi engellenir.
3. 35-45 kb büyüklüğündeki ökaryotik DNA fragmentleri linear hale getirilmiş plazmidle muamele edilir.
4. Bu hale getirilmiş cosmid vektör virusun kapsidi içine konur. Virusun bakteriyi enfekte etmesi sağlanır. Virus içindeki bu yapıyı bakteriye verir. Bakteri içine giren bu rekombinant DNA cos genleri ile halkasal hale gelir.
5. Daha sonra bu vektör, üzerinde bulunan orjin noktası ve antibiyotiğe direnç geni sebebiyle antibiyotik bulunan kültürlerde bakteri tarafından çoğaltılır.

SHUTTLE (= EKSPRESYON) VEKTÖR

Bu vektörün en büyük özelliği iki alıcı hücresinin bulunmasıdır. Vektör bu alıcı hücrelerin birisinde sayısal olarak çoğalırken, diğerinde klonladığımız geni ürüne dönüştürür.

Üzerinde her iki alıcı hücrede de çoğalmasını sağlayacak orjin noktaları ve her iki konumda da ayırdedilebileceği marker genleri taşır.

Bu vektör üzerinde bakteriye ait orjin ve ampisiline direnç geni vardır. Eğer bu yapı transformasyonla ampisiline hassas bakteriye verilir ve besiyeri ortamına da ampisilin konursa bakteri bu yapıyı çoğaltacaktır. Böylece klonlanan genin yapısı incelenebilir.

Bu yapıyı Leu` olan mayalara transforme eder ve besiyeri ortamına leusin koymazsak, maya leusin ihtiyacını vektördeki Leu (+) genini ürüne dönüştürerek gidecektir. Leusin oluşurken klonladığımız DNA bölgeside ürüne dönüşmüş olacaktır. Bu yapı sayesinde de genin fonksyonu çalışılabilir.

Bu sistem tıbbi ve biyolojik olarak önemli proteinlerin doğal kaynaklardan bol miktarda elde edilmesini sağlar.





Tİ PLAZMİDİ

Bitkilerdeki genetik mühendisliği çalışmaları için en önemli araç toprak bakterisi olan Agrobacterium tumefaciens ‘ in Ti plazmididir.

Agrobacterium ile enfekte bitkilerde tümör oluştuğu görülür. Bakterinin bitkide tümör hücresi oluşturabilmesi için bitkiye bir yapı aktarması gerekmektedir. Bakterinin bitkiye aktardığı yapı Ti plazmidi üzerinde bulunan T DNA bölgesidir. Bu gen bölgesi bitki kromozomuna entegre olur ve burada ifade olmaya başlar. Öyleyse bir bitkiye gen aktarılmak istendiğinde vektör olarak bu yapı kullanılabilir.

Öncelikle bakteriden plazmidi izole edilir. Plazmidin kesim noktası T DNA içindedir. Restriksiyon endonükleazla plazmid kesilir. Aynı restriksiyon endonükleazla kesilmiş klonlanacak gen plazmidle aynı ortama konur ve ortama DNA ligaz ilave edilir. Oluşan rekombinant Ti plazmidleri kültürdeki bitki hücrelerine verildiğinde üzerine klonlanacak geni taşıyan T DNA bitki hücre kromozumuna entegre olur. Bitki hücresinin bölünerek yeni bir bitki hücresi oluşturmasına izin verilir. Oluşan bitkinin her hücresi aynı zamanda klonlanan gen bölgesini içerir.

Bu yöntemle zararlılara karşı dirençli bitki varyeteleri oluşturulabileceği gibi büyüme hormonu ve grip aşısı içeren bitkiler de üretilebilir.

YAC VEKTÖRLER

Diğer vektörlerden ayrılan en büyük özelliği çok büyük miktarlarda (100.000-1.000.000 arası) DNA fragmentlerinin klonlanabilemesidir. Bu vektör en yaygın olarak insan kromozomlarının fiziksel haritasının çıkarılmasında , insan genom projesinde kullanılmaktadır.

Vektörün yapısına bakacak olursak:

CEN: sentromer dizilerini içerirler. Hücre bölünmesi sırasında vektörün kardeş hücrelere ayrılmasını sağlar.

ORİ: replikasyon orjini

ARS: otonom olarak çoğalmayı sağlayan gen dizileridir.

TEL: telomer bölgeleridir. Linear hale getirilmiş yapının stabilitesini sağlar ve nükleazlar tarafından kesilmesini engeller.

MARKERLAR: 3 marker vardır;

SUP4: bu marker SmaI in kesme noktasını içerir. Böylece yapının kesilip linear hale getirilip getirilemediği kontrol edilir . yapı linear hale gelmiş ise bu gen iş göremez hale gelmiştir.

URA 3 ve TRP I : eğer yapı kesilmiş ise iki kola ayrılmış demektir. Bu markerlar yapının sağ ve sol kolunu belirler. URA 3 sağ kolda TRP I ise sol kolda bulunur.

Ayrıca yapı BamHI ile kesilerek uçlarda telomer kısımları kalacak hale getirilir. Bu aşamadan sonra sağ ve sol kol haline gelmiş vektöre klonlanacak DNA bölgesi DNA ligazla birlikte ilave edilerek rekombinant yapı oluşturulur ve maya hücresine verilir.

YAC VEKTÖRLERİNİN KULLANIM ALANLARI

* Mutant genlerin incelenmesinde

Mutant farelere bir seri fare genom fragmenti verildiği takdirde mutant genlerde bir düzelme beklenir. Örn: Tirozinaz’ın normal kopyasını taşıyan YAC vektörü albino fareye verildiğinde pigment oluşumuna neden olduğu görülmüştür. Bu ; genlerin tanımlanabilmesi için bir yoldur.

* Genetik hastalıkların izlenmesinde

Insan genetik hastalıklarının farelerdeki modellerinin gözlenmesinde kullanılır. Örn : Down sendromlu ( trizomi ) fareler üretilerek hastalığın seyri gözlenebilir.

* Insan hastalıklarının araştırılması ve tedavisinde

Transgenik fareler üretilerek insan hastalıklarının incelenmesinde ve bu hastalıkların tedavisinde kullanılırlar. Örn : araştırmacılar insan immunoglobulin genleri taşıyan transgenik fareler geliştirmişlerdir. Bu fareler hastallıkların tedavisinde potansiyel bir annntikor kaynağı durumundadırlar.

YAC vektörleri kullanılarak transgenik farelerin eldesi:

* YAC vektörleri fare zigotunun pronükleusuna mikroinjeksiyonla verilir. Zigot uterusa yerleştirilir ve normal gelişimi gözlenir.
* Diğer bir yöntem fare embriyonik kök hücresinin alıcı hücre olarak kullanılmasıdır.
* DNA-lipid kompleksi endositozla kök hücre tarafından alınır.
* YAC ile kök hücre genomunun kaynaşması sağlanır. Bu hücre blastosist aşamasındaki fare embriyosuna ilave edilir.